五色荧光标记 20 个基因座复合扩增体系及法医学应用 姜先华1 ，贾 菲1 ，赵金玲1 ，沈红缨1 ，陈初光2 ，金 萍2 ， 郭 飞3 ，李秋阳1 ，邵 武1 ，于 蛟1 ( 1． 辽宁省刑事科学技术研究所，辽宁 沈阳 110032; 2. 基点认知技术( 北京) 有限公司，北京 100190; 3. 中国医科大学法医学院，辽宁 沈阳 110002 ) 【摘要】目的 建立 20 个基因座五色荧光标记复合扩增检测体系，并评价其法医学应用价值。方法 收集 368 份 无关人血样及 55 份实际案例样本( 包括血斑、体液斑、组织及毛发) ，采用五色荧光素标记技术，对 Amelogenin 和 19 个 STR 基因座( D19S433、D5S818、D21S11、D18S51、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、Penta D、vWA 、 D8S1179、TPOX、Penta E、TH01、D12S391、D2S1338 和 FGA) 进行基因型检测，并考察方法的一致性、灵敏度、种属特异性 及检材适用性。结果 本文五色荧光标记复合扩增检测体系可对所选 20 个基因座分型，结果稳定准确，且均衡性良好、 无杂峰; 群体调查显示累积个人识别率和累积非父排除率分别是 0. 999 999 999 999 999 999 999 和 0. 999 999 99; 灵敏度 达 125pg，种属特异性高，实际案例检材分型成功率高。结论 本文五色荧光标记复合扩增检测体系各项指标可达到当 前商品化试剂盒的检测水平，具有重要的法医学应用价值。 【关键词】法医物证学; 五色荧光标记; 复合 PCR; 20 个基因座; 法医 DNA 分型 【中图分类号】DF795. 2 【文献标识码】A 【文章编号】1001 － 5728( 2012) 03 － 0185 － 05 Development of a 20-locus STR fluorescent-multiplex PCR for forensic purposes( Jiang Xianhua 1 ，Jia Fei 1 ，Zhao Jinling 1 ，Shen Hongying 1 ，Chen Chuguang 2 ，Jin Ping 2 ，Guo Fei 3 ，Li Qiuyang 1 ，Shao Wu1 ，Yu Jiao 1 /1. Liaoning Criminal Science and Technology Institute，Shenyang 110032，China; 2. Peoplespot Inc． ， Beijing 100190，China; 3. China Medical University School of Forensic Medicine，Shenyang 110002，China) 【Abstract】Objective To construct a 20-locus STR fluorescent-multiplex PCR for forensic purposes． Methods 368 unrelated individual blood samples and 55 routine case samples ( including bloodstains，body fluid stains，tissues，and hairs) were collected． Amelogenin and 19 STR loci ( D19S433，D5S818，D21S11， D18S51，D6S1043，D3S1358，D13S317，D7S820，D16S539，CSF1PO，Penta D，vWA，D8S1179，TPOX， Penta E，TH01，D12S391，D2S1338 and FGA) were used to construct a 20-plex PCR system using a fivecolor fluorescence labeling technique，and then the consistency，sensitivity，species-specificity and biological samples applicability were evaluated． Results The 20-locus STR fluorescent-multiplex PCR system was of well accuracy，stability and balance，which showed rich genetic information ( the cumulative discrimination power and cumulative chance of exclusion reached to 0. 999 999 999 999 999 999 999 and 0. 999 999 99 respectively) ，high sensitivity ( 125pg) ，high species-specificity and high genotyping success rate for routine biological samples． Conclusion The performance of this 20-locus STR fluorescent-multiplex PCR system can win that of the current commercial kits，and it has important application value in forensic science． 【Key words】forensic biological evidence; fivecolored fluorescently-labeled; PCR multiplex; 20 loci; forensic DNA typing 多色荧光 STR 复合扩增技术具有高效、灵敏、稳 定等优点，在法医 DNA 分析广泛采用［1］。目前常用 的 16 个基因座检测方法中，AmpFISTR Identifiler TM、 Sinofiler TM ( 美 国 AB 公 司 ) 为 五 色 荧 光 标 记， PowerPlex16 ( 美 国 Promega 公 司) 和 GoldeneyeTM 16A、16BT、16C( 中国基点认知公司) 均为四色荧光标 记［2］。五色荧光比四色荧光标记技术容纳更多的基 因座，可增加一次检验基因座的数量，提高数据库应 ·185· 中国法医学杂志 CHIN J FORENSIC MED 2012 年第 27 卷第 3 期 用效率和个人识别能力，并可与目前普遍使用的毛细 管电泳检测仪器相适应。本文采用五色荧光复合扩 增技术对 20 个基因座进行检测，并考察该体系各项 技术指标，为法庭科学 DNA 分析提供一种新方法。 1 材料与方法 1. 1 样品 用于方法考察及群体遗传学分析的无关个体血 痕样本 368 份; 用于法医学应用研究的已知个体来源 的案件检材 55 份，包括 10 份血斑、10 份精液/女性阴 道液混合斑、10 份汗液斑、10 份唾液斑、5 份肋软骨、 5 份肌肉组织和 5 份毛发; 均为本实验室 2000 － 2010 年采集或检案积累。用于特异性检验的猪、鸡、鱼样 品购于本市农贸市场。 1. 2 复合扩增体系的建立 1. 2. 1 基因座的选择 为获得更多信息量，提高非父排除率和个人识别 力，本文依照《我国法庭科学 DNA 数据库选用的基因 座》( GA469 － 2004) 标准，并兼容当前 DNA 身份鉴定 常用试剂盒的全部 STR 基因座的原则，选定了 20 个 基因座，相关信息见表 1。 表 1 20 个基因座的相关信息 Table 1 Related information of 20 STR Loci 基因座 染色体定位 等位基因 范围 PCR 产物 长度/bp 荧光标 记物 D19S433 19q12 ～ 13. 1 9 ～ 17. 2 91 ～ 127 FAM D5S818 5q21 ～ 31 7 ～ 15 142 ～ 175 FAM D21S11 21q21. 1 24 ～ 38 198 ～ 256 FAM D18S51 18q21. 3 8 ～ 27 283 ～ 357 FAM D6S1043 6q16. 1 9 ～ 21. 3 376 ～ 428 FAM D3S1358 3p21 12 ～ 20 123 ～ 156 HEX D13S317 13q22 ～ 31 7 ～ 15 171 ～ 204 HEX D7S820 7q11. 21 ～ 22 6 ～ 14 212 ～ 245 HEX D16S539 16q22 ～ 24 5 ～ 15 260 ～ 301 HEX CSF1PO 5q33. 3 ～ 34 6 ～ 15 319 ～ 354 HEX Penta D 21q22. 3 2. 2 ～ 17 369 ～ 441 HEX Amel Xp22. 1 ～ 22. 3，Y X/Y 106 /112 TMR vWA 12p12 ～ pter 10 ～ 22 124 ～ 172 TMR D8S1179 8q24. 1 ～ 24. 2 7 ～ 18 203 ～ 248 TMR TPOX 2p23 ～ 2pter 7 ～ 13 274 ～ 299 TMR Penta E 15q26. 2 5 ～ 26 322 ～ 423 TMR TH01 11p15 ～ 15. 5 4 ～ 13. 3 94 ～ 134 ROX D12S391 12p13. 2 14 ～ 27 145 ～ 197 ROX D2S1338 2q35 ～ 37. 1 15 ～ 28 215 ～ 268 ROX FGA 4q28 16 ～ 46. 2 278 ～ 402 ROX 1. 2. 2 引物的设计和合成 引物设计原则为: 20 ～ 30bp 之间，各基因座引物 Tm 值尽量一致; PCR 产物片段长度在 450bp 以内。 引物经 HPLC 检测分析，纯度大于 99% 。依据荧光素 光谱特性、检测灵敏度等对常用的荧光标记物进行比 较，选出彼此干扰最小的 5 种荧光素组合标记引物 ( 表 1) 。 1. 2. 3 复合扩增体系的建立和优化 建立 20 个基因座的复合扩增体系，并进行调整、 优化实验［3-6］: 引物浓度 设置梯度( 0. 10、0. 15、0. 20、0. 25、 0. 30、0. 35μmol /L) 。 引物退火温度 设置梯度( 56、57、58、59、60、 61、62℃ ) 。 缓冲液浓度 设置梯度( 0. 10、0. 15、0. 20、0. 25、 0. 30、0. 35μmol /L) 。 模板浓度 以 9947A 标准品 DNA( 10ng /μL) 为 模板，设置梯度( 0. 25、0. 5、0. 75、1. 0、1. 25、1. 5、2. 0、 2. 5ng) 。 PCR 循环次数 在以上确定的最佳引物浓度、退 火温度、缓冲液浓度、DNA 浓度条件下，设置 PCR 循 环次数梯度( 27、28、29、30、31、32) 。 1. 2. 4 PCR 产物的检测 采 用 ABI 3130 XL 型 遗 传 分 析 仪 及 GeneMapper3. 2 软件对 PCR 产物进行检测和分型。 编制与复合扩增体系中的基因座相对应 Panel 和与等 位基因数据项对应 Bin，导入 GeneMapper3. 2 软件用 于分析判型。 1. 3 扩增体系指标验证及法医学应用 1. 3. 1 扩增体系技术指标验证 一致性 368 份无关个体血样采用 TECAN 工作 站磁珠 法 提 取 DNA，STR 分 型 结 果 与 Sinofiler TM 和 PowerPlex16分型结果进行一致性和成功率比较。 灵敏度 采用美国 Promega 公司的 9947ADNA ( 10ng /μL) 进行灵敏度检测。模板定量为 2、1、0. 5、 0. 25、0. 125、0. 062 5ng 进行检测，平行重复 3 次。 种属特异性 设置人源性和非人源性检材( 猪、 鸡、鱼) ，测试方法的种属特异性。 1. 3. 2 案件检材应用 血斑、混合斑、汗液斑、唾液斑、肋软骨、肌肉组织 和毛发样本，经 Chelex100 法提取 DNA，采用本文方 法检测，与 Sinofiler TM和 PowerPlex16分型结果比对。 2 结果与讨论 2. 1 检测方法及遗传学调查 本文 最 终 选 择 的 五 色 荧 光 复 合 扩 增 总 体 系 ·186· 中国法医学杂志 CHIN J FORENSIC MED 2012 年第 27 卷第 3 期 10μL，内含: 模板 DNA0. 5ng、2. 5 × PCR 缓冲液 4μL、 5 × 引物混合物 2μL、Gold Taq 1U0. 2μL。PCR 循环 参数为: 95℃ 5min; 94℃ 30s、60℃ 1min、70℃ 1min， 共 30 次循环; 最后 60℃ 延伸 30min。电泳检测: 取 1μL PCR 产 物、8. 5μL 去 离 子 甲 酰 胺、0. 5μL ORANGE 500 分子量内标，混匀，95℃变性 3min，立即 冰浴; 使用 ABI 3130XL 型遗传分析仪电泳分离，毛细 管 36cm，“DyeSet”选择“E5”。采用 GeneMapper  ID v3. 2 软件进行分析。结果表明，本方法可对所选 20 个基因座成功分型，且均衡性良好，峰型对称尖锐、无 双肩峰等杂峰。 应用本文方法对 368 份无关个体血痕样本进行 检测，19 个 STR 基因座数据采 用直接计数法和 PowerStats V12 软件( http: / /www． promega． com) 进行 遗传学统计分析。结果表明: 各基因座基因型观察值 和期望值之间无显著差异，均符合 Hardy-Weinberg 平 衡定律( P ＞ 0. 05) 。19 个 STR 基因座的等位基因及 其频率以及相关遗传学参数见表 2、3。 表 2 19 个 STR 基因座的等位基因频率以及遗传学参数( n = 368) Table 2 Allele frequencies and genetic parameters for 19 STR loci in Northern Han unrelated individuals D8S1179 D5S818 D7S820 D18S51 FGA D2S1338 D3S1358 D16S539 A F A F A F A F A F A F A F A F 10 0. 100 3 6 0. 001 4 7 0. 002 7 10 0. 001 4 15 0. 001 4 13 0. 001 4 12 0. 001 4 8 0. 013 7 11 0. 067 3 7 0. 016 5 8 0. 131 9 11 0. 005 5 18 0. 023 4 16 0. 005 5 14 0. 031 6 9 0. 289 8 12 0. 144 2 8 0. 001 4 9 0. 070 1 12 0. 038 5 18. 2 0. 001 4 17 0. 072 8 15 0. 340 7 10 0. 144 2 13 0. 221 2 9 0. 072 8 9. 1 0. 004 1 13 0. 212 9 19 0. 046 7 18 0. 111 3 16 0. 355 8 11 0. 222 5 14 0. 195 1 10 0. 217 0 10 0. 162 1 14 0. 222 5 20 0. 064 6 19 0. 129 1 17 0. 200 5 12 0. 211 5 15 0. 175 8 11 0. 339 3 10. 1 0. 001 4 15 0. 155 2 21 0. 076 9 20 0. 125 0 18 0. 063 2 13 0. 098 9 16 0. 074 2 12 0. 210 2 10. 3 0. 001 4 16 0. 112 6 21. 2 0. 001 4 21 0. 028 8 19 0. 006 9 14 0. 016 5 17 0. 017 9 13 0. 131 9 11 0. 317 3 17 0. 081 0 22 0. 169 0 22 0. 049 5 15 0. 002 7 18 0. 004 1 14 0. 006 9 12 0. 252 7 18 0. 041 2 22. 2 0. 009 6 23 0. 247 3 TH01 Penta E 15 0. 002 7 12. 1 0. 001 4 19 0. 033 0 23 0. 215 7 24 0. 156 6 A F A F CSF1PO 13 0. 053 6 20 0. 039 8 23. 2 0. 013 7 25 0. 060 4 6 0. 098 9 5 0. 039 8 A F D13S317 14 0. 001 4 21 0. 020 6 24 0. 207 4 26 0. 012 4 7 0. 241 8 7 0. 001 4 8 0. 002 7 A F D21S11 22 0. 024 7 24. 2 0. 005 5 8 0. 057 7 8 0. 001 4 9 0. 041 2 7 0. 002 7 A F 23 0. 006 9 25 0. 104 4 D6S1043 9 0. 533 0 9 0. 009 6 10 0. 237 6 8 0. 273 4 26 0. 001 4 24 0. 004 1 25. 2 0. 002 7 A F 9. 3 0. 045 3 10 0. 049 5 11 0. 251 4 9 0. 148 4 27 0. 001 4 26 0. 048 1 8 0. 001 4 10 0. 019 2 11 0. 122 3 12 0. 038 5 10 0. 145 6 28 0. 045 3 D12S391 27 0. 002 7 9 0. 001 4 10. 3 0. 001 4 12 0. 129 1 13 0. 063 2 11 0. 211 5 28. 2 0. 008 2 A F 28 0. 002 7 10 0. 037 1 13 0. 050 8 14 0. 015 1 12 0. 173 1 29 0. 241 8 14 0. 001 4 29 0. 002 7 11 0. 104 4 Penta D 14 0. 079 7 15 0. 002 7 13 0. 035 7 29. 2 0. 002 7 15 0. 013 7 12 0. 123 6 A F 15 0. 104 4 14 0. 009 6 30 0. 318 7 16 0. 005 5 D19S433 13 0. 159 3 6 0. 008 2 16 0. 086 5 vWA 30. 2 0. 012 4 17 0. 086 5 A F 14 0. 133 2 7 0. 005 5 17 0. 083 8 A F TPOX 30. 3 0. 005 5 18 0. 245 9 12 0. 050 8 15 0. 011 0 8 0. 033 0 18 0. 074 2 13 0. 002 7 A F 31 0. 108 5 19 0. 229 4 12. 2 0. 002 7 16 0. 002 7 9 0. 324 2 18. 3 0. 001 4 14 0. 247 3 7 0. 001 4 31. 2 0. 067 3 20 0. 175 8 13 0. 311 8 17 0. 038 5 10 0. 133 2 19 0. 056 3 15 0. 030 2 8 0. 512 4 32 0. 028 8 21 0. 098 9 13. 2 0. 038 5 17. 3 0. 001 4 11 0. 158 0 19. 1 0. 001 4 16 0. 190 9 9 0. 111 3 32. 2 0. 108 5 22 0. 075 5 14 0. 251 4 18 0. 162 1 12 0. 169 0 20 0. 046 7 17 0. 222 5 10 0. 030 2 33 0. 006 9 23 0. 042 6 14. 2 0. 118 1 19 0. 153 8 13 0. 136 0 21 0. 027 5 18 0. 200 5 11 0. 321 4 33. 1 0. 001 4 24 0. 015 1 15 0. 059 1 20 0. 059 1 14 0. 026 1 22 0. 017 9 19 0. 092 0 12 0. 020 6 33. 2 0. 031 6 25 0. 005 5 15. 2 0. 120 9 20. 3 0. 001 4 15 0. 005 5 23 0. 009 6 20 0. 013 7 13 0. 002 7 34 0. 002 7 26 0. 004 1 16 0. 015 1 21 0. 005 5 17 0. 001 4 24 0. 002 7 34. 1 0. 001 4 16. 2 0. 030 2 21. 3 0. 002 7 26 0. 002 7 34. 2 0. 005 5 17. 2 0. 001 4 22. 3 0. 001 4 27 0. 001 4 ·187· 中国法医学杂志 CHIN J FORENSIC MED 2012 年第 27 卷第 3 期 从表 2、3 可见，除 D3S1358、CSF1PO、TPOX、TH01 4 个基因座外均为高杂合度( H ＞ 0. 7) 、高识别能力( DP ＞0. 9) 和高信息量( PIC ＞ 0. 7) 基因座［7］。本方法累 积个人识别能力为0. 999 999 999 999 999 999 999，高 于 Identifiler TM 和 PowerPlex16［8-9］，累积非父排除率 为 0. 999 999 99，可为法庭科学 DNA 分析工作提供更 加准确的判断依据，且可做到一次检测获得更多信 息，对数据库建设和实际案件有重要意义。 表 3 19 个 STR 基因座遗传学参数( n = 368) Table 3 Genetic parameters for 19 STR loci in Northern Han unrelated individuals 参数 D8S1179 D5S818 D7S820 D18S51 FGA D2S1338 D3S1358 D16S539 CSF1PO vWA He 0. 857 0. 783 0. 794 0. 841 0. 885 0. 893 0. 687 0. 816 0. 766 0. 813 DP 0. 953 0. 908 0. 920 0. 962 0. 961 0. 962 0. 869 0. 923 0. 874 0. 930 PIC 0. 820 0. 740 0. 750 0. 740 0. 840 0. 840 0. 660 0. 760 0. 680 0. 770 PE 0. 709 0. 568 0. 588 0. 677 0. 764 0. 781 0. 408 0. 629 0. 538 0. 624 参数 D13S317 TPOX D21S11 D12S391 D19S433 D6S1043 TH01 Penta D Penta E He 0. 799 0. 613 0. 841 0. 846 0. 830 0. 863 0. 647 0. 794 0. 931 DP 0. 932 0. 798 0. 936 0. 947 0. 933 0. 969 0. 814 0. 935 0. 985 PIC 0. 780 0. 560 0. 780 0. 810 0. 780 0. 860 0. 600 0. 780 0. 910 PE 0. 598 0. 306 0. 677 0. 687 0. 655 0. 720 0. 352 0. 588 0. 860 2. 2 方法指标验证 一致性 368 份无关个体血样经该方法检测得 到的分型与 Sinofiler TM和 PowerPlex16 相同基因座的 分型结果完全一致，说明该检测方法具有良好的准确 性和一致性。 灵敏度 经对不同模板量进行检测，最佳模板量 为 0. 125 ～ 1. 0ng，峰高均值在 500 ～ 2 000Rfu 之间。 模板量低至 0. 062 5ng 仍可获得完整 STR 分型结果， 但峰值小于 100Rfu，亦可出现杂合子峰高不均衡现 象。模板量为 2. 0ng 时，峰值达 6 000Rfu，易出现拔 起峰及杂峰，影响结果判读( 图 1) 图 1 灵敏度检测结果 Fig 1 The results of sensitivity study 种属特异性 采用本文方法检测猪、鱼、鸡的 DNA 样品，结果与 Identifiler TM所报道的种属特异性检 测结果一致［10］。鱼和鸡样品结果为阴性，猪样品图 谱分型区内均无扩增产物，仅在性别位点前出现 103bp 非特异性扩增峰，但不影响人源 DNA 判型( 图 2) 。结果表明本文方法具有良好的种属特异性。 图 2 种属特异性检测结果 Fig 2 The results of species specificity study 2. 3 实际案例检材应用 55 份案例检材经 Chelex100 法提取 DNA，采用本 文方法进行分型检测，与 Sinofiler TM 和 PowerPlex16 结果进行比对，各基因座均获得一致的分型结果。当 检材为低拷贝模板时，可获得的基因座数量更多。例 如某案例的甲醛固定石蜡包埋样本，采用本文方法和 ·188· 中国法医学杂志 CHIN J FORENSIC MED 2012 年第 27 卷第 3 期 Sinofiler TM使用相同模板量及电泳参数进行检测，本文 方法得到 10 个基因座的分型，而 Sinofiler TM仅得到 7 个基因座的分型，且前者平均峰高高于后者( 图 3) 。 图 3 经两种方法对甲醛固定石蜡包埋 检材样本的检测结果 Fig 3 Electropherograms from the formaldehydefixed paraffin-embedded tissue specimen 综上，本文建立的五色荧光标记复合扩增体系， 可对生物检材 20 个基因座进行检测，其个体识别能 力、非父排除能力、检测灵敏度和检材适用性等均可 达到当前商品化试剂盒的检测水平，为法医 DNA 分 析检测提供了新方法，并因其可检测到更多基因座， 故在提高数据库比对中具有巨大应用潜力。 参 考 文 献 ［1］Krenke B E，Tereba A，Anderson S J，et a1. 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( 收稿日期: 2011-06-23) ( 上接第 184 页) ［10］Rousset F． GENEPOP ' 007: a complete reimplementation of the GENEPOP software for Windows and Linux［J］． Molecular ecology notes，2008，8: 103-106. ［11］伍新尧，杨庆恩，刘雅诚，等． 亲权鉴定判断标准和结论 表述的建立［J］． 中山大学学报( 医学科学版) ，2010，31