采用自主研发似然比率计算器进行ITO亲缘关系分析

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五色荧光标记20个基因座复合扩增体系及法医学应用

五色荧光标记20个基因座复合扩增体系及法医学应用

五色荧光标记20个基因座复合扩增体系及法医学应用姜先华1,贾菲1,赵金玲1,沈红缨1,陈初光2,金萍2,郭飞3,李秋阳1,邵武1,于蛟1(1.辽宁省刑事科学技术研究所,辽宁沈阳110032;2.基点认知技术(北京)有限公司,北京100190;3.中国医科大学法医学院,辽宁沈阳110002)【摘要】目的建立20个基因座五色荧光标记复合扩增检测体系,并评价其法医学应用价值。方法收集368份无关人血样及55份实际案例样本(包括血斑、体液斑、组织及毛发),采用五色荧光素标记技术,对Amelogenin和19个STR基因座(D19S433、D5S818、D21S11、D18S51、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、PentaD、vWA、D8S1179、TPOX、PentaE、TH01、D12S391、D2S1338和FGA)进行基因型检测,并考察方法的一致性、灵敏度、种属特异性及检材适用性。结果本文五色荧光标记复合扩增检测体系可对所选20个基因座分型,结果稳定准确,且均衡性良好、无杂峰;群体调查显示累积个人识别率和累积非父排除率分别是0.999999999999999999999和0.99999999;灵敏度达125pg,种属特异性高,实际案例检材分型成功率高。结论本文五色荧光标记复合扩增检测体系各项指标可达到当前商品化试剂盒的检测水平,具有重要的法医学应用价值。【关键词】法医物证学;五色荧光标记;复合PCR;20个基因座;法医DNA分型【中图分类号】DF795.2【文献标识码】A【文章编号】1001-5728(2012)03-0185-05Developmentofa20-locusSTRfluorescent-multiplexPCRforforensicpurposes(JiangXianhua1,JiaFei1,ZhaoJinling1,ShenHongying1,ChenChuguang2,JinPing2,GuoFei3,LiQiuyang1,ShaoWu1,YuJiao1/1.LiaoningCriminalScienceandTechnologyInstitute,Shenyang110032,China;2.PeoplespotInc.,Beijing100190,China;3.ChinaMedicalUniversitySchoolofForensicMedicine,Shenyang110002,China)【Abstract】ObjectiveToconstructa20-locusSTRfluorescent-multiplexPCRforforensicpurposes.Methods368unrelatedindividualbloodsamplesand55routinecasesamples(includingbloodstains,bodyfluidstains,tissues,andhairs)werecollected.Amelogeninand19STRloci(D19S433,D5S818,D21S11,D18S51,D6S1043,D3S1358,D13S317,D7S820,D16S539,CSF1PO,PentaD,vWA,D8S1179,TPOX,PentaE,TH01,D12S391,D2S1338andFGA)wereusedtoconstructa20-plexPCRsystemusingafivecolorfluorescencelabelingtechnique,andthentheconsistency,sensitivity,species-specificityandbiologicalsamplesapplicabilitywereevaluated.ResultsThe20-locusSTRfluorescent-multiplexPCRsystemwasofwellaccuracy,stabilityandbalance,whichshowedrichgeneticinformation(thecumulativediscriminationpowerandcumulativechanceofexclusionreachedto0.999999999999999999999and0.99999999respectively),highsensitivity(125pg),highspecies-specificityandhighgenotypingsuccessrateforroutinebiologicalsamples.ConclusionTheperformanceofthis20-locusSTRfluorescent-multiplexPCRsystemcanwinthatofthecurrentcommercialkits,andithasimportantapplicationvalueinforensicscience.【Keywords】forensicbiologicalevidence;fivecoloredfluorescently-labeled;PCRmultiplex;20loci;forensicDNAtyping多色荧光STR复合扩增技术具有高效、灵敏、稳定等优点,在法医DNA分析广泛采用[1]。目前常用的16个基因座检测方法中,AmpFISTRIdentifilerTM、SinofilerTM(美国AB公司)为五色荧光标记,PowerPlex16(美国Promega公司)和GoldeneyeTM16A、16BT、16C(中国基点认知公司)均为四色荧光标记[2]。五色荧光比四色荧光标记技术容纳更多的基因座,可增加一次检验基因座的数量,提高数据库应·185·中国法医学杂志CHINJFORENSICMED2012年第27卷第3期用效率和个人识别能力,并可与目前普遍使用的毛细管电泳检测仪器相适应。本文采用五色荧光复合扩增技术对20个基因座进行检测,并考察该体系各项技术指标,为法庭科学DNA分析提供一种新方法。1材料与方法1.1样品用于方法考察及群体遗传学分析的无关个体血痕样本368份;用于法医学应用研究的已知个体来源的案件检材55份,包括10份血斑、10份精液/女性阴道液混合斑、10份汗液斑、10份唾液斑、5份肋软骨、5份肌肉组织和5份毛发;均为本实验室2000-2010年采集或检案积累。用于特异性检验的猪、鸡、鱼样品购于本市农贸市场。1.2复合扩增体系的建立1.2.1基因座的选择为获得更多信息量,提高非父排除率和个人识别力,本文依照《我国法庭科学DNA数据库选用的基因座》(GA469-2004)标准,并兼容当前DNA身份鉴定常用试剂盒的全部STR基因座的原则,选定了20个基因座,相关信息见表1。表120个基因座的相关信息Table1Relatedinformationof20STRLoci基因座染色体定位等位基因范围PCR产物长度/bp荧光标记物D19S43319q12~13.19~17.291~127FAMD5S8185q21~317~15142~175FAMD21S1121q21.124~38198~256FAMD18S5118q21.38~27283~357FAMD6S10436q16.19~21.3376~428FAMD3S13583p2112~20123~156HEXD13S31713q22~317~15171~204HEXD7S8207q11.21~226~14212~245HEXD16S53916q22~245~15260~301HEXCSF1PO5q33.3~346~15319~354HEXPentaD21q22.32.2~17369~441HEXAmelXp22.1~22.3,YX/Y106/112TMRvWA12p12~pter10~22124~172TMRD8S11798q24.1~24.27~18203~248TMRTPOX2p23~2pter7~13274~299TMRPentaE15q26.25~26322~423TMRTH0111p15~15.54~13.394~134ROXD12S39112p13.214~27145~197ROXD2S13382q35~37.115~28215~268ROXFGA4q2816~46.2278~402ROX1.2.2引物的设计和合成引物设计原则为:20~30bp之间,各基因座引物Tm值尽量一致;PCR产物片段长度在450bp以内。引物经HPLC检测分析,纯度大于99%。依据荧光素光谱特性、检测灵敏度等对常用的荧光标记物进行比较,选出彼此干扰最小的5种荧光素组合标记引物(表1)。1.2.3复合扩增体系的建立和优化建立20个基因座的复合扩增体系,并进行调整、优化实验[3-6]:引物浓度设置梯度(0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35μmol/L)。引物退火温度设置梯度(56、57、58、59、60、61、62℃)。缓冲液浓度设置梯度(0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35μmol/L)。模板浓度以9947A标准品DNA(10ng/μL)为模板,设置梯度(0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2.0、2.5ng)。PCR循环次数在以上确定的最佳引物浓度、退火温度、缓冲液浓度、DNA浓度条件下,设置PCR循环次数梯度(27、28、29、30、31、32)。1.2.4PCR产物的检测采用ABI3130XL型遗传分析仪及GeneMapper3.2软件对PCR产物进行检测和分型。编制与复合扩增体系中的基因座相对应Panel和与等位基因数据项对应Bin,导入GeneMapper3.2软件用于分析判型。1.3扩增体系指标验证及法医学应用1.3.1扩增体系技术指标验证一致性368份无关个体血样采用TECAN工作站磁珠法提取DNA,STR分型结果与SinofilerTM和PowerPlex16分型结果进行一致性和成功率比较。灵敏度采用美国Promega公司的9947ADNA(10ng/μL)进行灵敏度检测。模板定量为2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625ng进行检测,平行重复3次。种属特异性设置人源性和非人源性检材(猪、鸡、鱼),测试方法的种属特异性。1.3.2案件检材应用血斑、混合斑、汗液斑、唾液斑、肋软骨、肌肉组织和毛发样本,经Chelex100法提取DNA,采用本文方法检测,与SinofilerTM和PowerPlex16分型结果比对。2结果与讨论2.1检测方法及遗传学调查本文最终选择的五色荧光复合扩增总体系·186·中国法医学杂志CHINJFORENSICMED2012年第27卷第3期10μL,内含:模板DNA0.5ng、2.5×PCR缓冲液4μL、5×引物混合物2μL、GoldTaq1U0.2μL。PCR循环参数为:95℃5min;94℃30s、60℃1min、70℃1min,共30次循环;最后60℃延伸30min。电泳检测:取1μLPCR产物、8.5μL去离子甲酰胺、0.5μLORANGE500分子量内标,混匀,95℃变性3min,立即冰浴;使用ABI3130XL型遗传分析仪电泳分离,毛细管36cm,“DyeSet”选择“E5”。采用GeneMapperIDv3.2软件进行分析。结果表明,本方法可对所选20个基因座成功分型,且均衡性良好,峰型对称尖锐、无双肩峰等杂峰。应用本文方法对368份无关个体血痕样本进行检测,19个STR基因座数据采用直接计数法和PowerStatsV12软件(http://www.promega.com)进行遗传学统计分析。结果表明:各基因座基因型观察值和期望值之间无显著差异,均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。19个STR基因座的等位基因及其频率以及相关遗传学参数见表2、3。表2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