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关于“峰”异常
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关于“峰”异常

关于“峰”异常

  • 分类:常见问题
  • 作者:
  • 来源:
  • 发布时间:2019-09-16 10:22
  • 访问量:23
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问题

可能原因

解决方案

没有峰或峰很弱

模板DNA不纯,含有PCR抑制剂,如血红素、酸、染料等

DNA进行纯化或者改变提取DNA的方法

模板DNA量不足

用推荐量的DNA

没有将buffer、引物或master mix充分混匀

重复振荡混匀,离心机短暂离心,再使用或者分装

酶活性不足

用推荐量的DNA聚合酶,查看是否过期

扩增程序不正确

确认扩增程序

高盐浓度或pH改变

DNA体积不得超过总体积的20%,样本中过多的钾、钠、镁离子或EDTA可影响PCRpH的改变也会影响PCR

热循环仪有问题

需要校正热循环仪的加热块,我们没有测试过其它品牌的反应管和热循环仪

引物浓度太低

用推荐量的引物浓度,并充分混匀

样品上样前未变性

确保样品变性后立即上样

毛细电泳进样差

重新进样,检查注射器O臂和激光源

去离子甲酰胺质量差

使用导电率小于100 μS/cm的去离子甲酰胺

有额外的杂峰出现

模板DNA被污染

用防回气加样头及更换手套

样品中含有较高浓度Mg2+,导致聚合酶特异性降低

将样品进一步纯化,去除离子

样品未完全变性

充分变性,立即上样

背景

减少上样量或降低上样时间

与毛细管电泳(CE)相关的鬼峰

微小电压变化或尿素结晶穿过扫描窗引起鬼峰,应重新进样

由污染产生的杂峰

有污染的水或缓冲液可在蓝色或绿色基因座产生杂峰,使用无菌水,清洗缓冲液容器

DNA过量

大于4 ng时可能产生杂峰,减少模板量或改用28个循环数扩增

Pull-up or bleed-through当峰高大于2000 rfu、产生的matrix不正确或质量不高时出现

提高峰域值(例如150~200 rfu)或生成新的matrix

由扩增产生的杂峰

通常比等位基因少4个核苷酸,上样量太大时峰变强

小分子量峰高,大分子量峰低或者没有峰

DNA过量,大于2 ng时在扩增过程中小基因座会产生优势扩增。

减少模板量或采用28循环数,使基因座间峰高达到平衡

DNA样本降解

DNA模板降解成小片段使大片段基因座扩增产量降低

DNA模板量不足

推荐使用1~2 ng DNA

使用FTA

减少热循环数,使基因座间峰高达到平衡

去离子甲酰胺质量差

使用导电率小于100 μS/cm的去离子甲酰胺

峰图上没有标出等位基因

分析参数和内标的分析类型不一致

分析参数和内标的分析类型都要选择“Basic or Advanced

没有选择Panel

Panel栏选择正确的Panel

没有选择size standard

size standard栏选择正确的内标

使用的内标片段范围不对

要确保所有的样本峰均在内标的范围内

电泳时间太短,导致内标中大片段未出现

重新电泳并延长电泳时间使内标中所有片段都被检测到

内标峰上所标的片段大小错误

Start pt选的不对

Start pt一定要选在第一个内标片段之前

内标中杂峰峰高过高以致于标上数值

光标加亮杂峰,击右键手动删除size label

电泳时间太短导致内标中的大片段未出现

重新电泳并延长电泳时间使内标中所有的片段都被检测到

内标峰上未出现数值

内标峰高过低

在分析方法中将red threshold的值适当降低

内标峰很杂乱,软件无法判别

光标加亮内标峰,击右键手动加上相应数值

 
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