关于“峰”异常
关于“峰”异常
问题 |
可能原因 |
解决方案 |
没有峰或峰很弱 |
模板DNA不纯,含有PCR抑制剂,如血红素、酸、染料等 |
将DNA进行纯化或者改变提取DNA的方法 |
模板DNA量不足 |
用推荐量的DNA |
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没有将buffer、引物或master mix充分混匀 |
重复振荡混匀,离心机短暂离心,再使用或者分装 |
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酶活性不足 |
用推荐量的DNA聚合酶,查看是否过期 |
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扩增程序不正确 |
确认扩增程序 |
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高盐浓度或pH改变 |
DNA体积不得超过总体积的20%,样本中过多的钾、钠、镁离子或EDTA可影响PCR,pH的改变也会影响PCR |
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热循环仪有问题 |
需要校正热循环仪的加热块,我们没有测试过其它品牌的反应管和热循环仪 |
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引物浓度太低 |
用推荐量的引物浓度,并充分混匀 |
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样品上样前未变性 |
确保样品变性后立即上样 |
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毛细电泳进样差 |
重新进样,检查注射器O臂和激光源 |
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去离子甲酰胺质量差 |
使用导电率小于100 μS/cm的去离子甲酰胺 |
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有额外的杂峰出现 |
模板DNA被污染 |
用防回气加样头及更换手套 |
样品中含有较高浓度Mg2+,导致聚合酶特异性降低 |
将样品进一步纯化,去除离子 |
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样品未完全变性 |
充分变性,立即上样 |
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背景 |
减少上样量或降低上样时间 |
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与毛细管电泳(CE)相关的鬼峰 |
微小电压变化或尿素结晶穿过扫描窗引起鬼峰,应重新进样 |
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由污染产生的杂峰 |
有污染的水或缓冲液可在蓝色或绿色基因座产生杂峰,使用无菌水,清洗缓冲液容器 |
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DNA过量 |
大于4 ng时可能产生杂峰,减少模板量或改用28个循环数扩增 |
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Pull-up or bleed-through当峰高大于2000 rfu、产生的matrix不正确或质量不高时出现 |
提高峰域值(例如150~200 rfu)或生成新的matrix |
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由扩增产生的杂峰 |
通常比等位基因少4个核苷酸,上样量太大时峰变强 |
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小分子量峰高,大分子量峰低或者没有峰 |
DNA过量,大于2 ng时在扩增过程中小基因座会产生优势扩增。 |
减少模板量或采用28循环数,使基因座间峰高达到平衡 |
DNA样本降解 |
DNA模板降解成小片段使大片段基因座扩增产量降低 |
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DNA模板量不足 |
推荐使用1~2 ng DNA |
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使用FTA纸 |
减少热循环数,使基因座间峰高达到平衡 |
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去离子甲酰胺质量差 |
使用导电率小于100 μS/cm的去离子甲酰胺 |
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峰图上没有标出等位基因 |
分析参数和内标的分析类型不一致 |
分析参数和内标的分析类型都要选择“Basic or Advanced” |
没有选择Panel |
在Panel栏选择正确的Panel |
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没有选择size standard |
在size standard栏选择正确的内标 |
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使用的内标片段范围不对 |
要确保所有的样本峰均在内标的范围内 |
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电泳时间太短,导致内标中大片段未出现 |
重新电泳并延长电泳时间使内标中所有片段都被检测到 |
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内标峰上所标的片段大小错误 |
Start pt选的不对 |
Start pt一定要选在第一个内标片段之前 |
内标中杂峰峰高过高以致于标上数值 |
光标加亮杂峰,击右键手动删除size label |
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电泳时间太短导致内标中的大片段未出现 |
重新电泳并延长电泳时间使内标中所有的片段都被检测到 |
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内标峰上未出现数值 |
内标峰高过低 |
在分析方法中将red threshold的值适当降低 |
内标峰很杂乱,软件无法判别 |
光标加亮内标峰,击右键手动加上相应数值 |